子宮內(nèi)膜異位癥是一種相對常見的疾病，影響了大約10%的育齡期女性。在青春期盆腔痛的患者中其發(fā)病率高達(dá)50%。臨床癥狀包括痛經(jīng)、盆腔痛和不孕。子宮內(nèi)膜異位癥被認(rèn)為是良性的、炎性的和雌激素依賴性的疾病。這種疾病常常引起多部位病變，包括盆腹腔腹膜和臟器。

有三種類型的子宮內(nèi)膜異位癥，包括表淺腹膜型、卵巢型和深部浸潤型。深部浸潤型子宮內(nèi)膜異位癥是浸潤盆腔局部的結(jié)節(jié)狀病灶。孕激素和GnRHa為主的內(nèi)分泌治療是子宮內(nèi)膜異位癥標(biāo)準(zhǔn)治療方法。但是并不是所有的患者都能耐受藥物治療所帶來的副反應(yīng)，而且也并不是所有的患者激素治療都有效，尤其是那些深部子宮內(nèi)膜異位癥的患者。外科手術(shù)切除也是治療方法之一，特別是對有生育要求的患者。但是外科手術(shù)完整切除深部子宮內(nèi)膜異位病灶需要較高的手術(shù)技巧，且手術(shù)是有風(fēng)險的。

除了臨床的良性行為和正常的組織學(xué)特征，深部子宮內(nèi)膜異位癥還具有惡性腫瘤的某些特點，例如局部侵襲和抗凋亡。子宮內(nèi)膜異位癥的病因?qū)W有爭議，其起源有幾個假說：撤退性出血使子宮內(nèi)膜碎片通過輸卵管遷移到盆腹腔腹膜，并在其漿膜層種植；子宮內(nèi)膜細(xì)胞通過脈管播散；盆腹腔腹膜和臟器表面的體腔上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；抑或骨髓來源干細(xì)胞或者胚胎殘余苗勒氏管細(xì)胞在撤退性出血的過程中流進(jìn)盆腹腔。

基因組相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)的遺傳印記。子宮內(nèi)膜異位癥，尤其是卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，被普遍認(rèn)為是卵巢透明細(xì)胞癌和卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌直接的前驅(qū)病變，也因此叫做子宮內(nèi)膜異位相關(guān)卵巢腫瘤。然而，對子宮內(nèi)膜異位癥體細(xì)胞突變的研究大部分限制在子宮內(nèi)膜異位共存的惡性腫瘤當(dāng)中。很少的候選基因的研究來研究良性（非癌相關(guān)）卵巢子宮內(nèi)膜異位癥。有一項試驗證實了在某個單一病變中存在KRAS基因p.G12C的突變。另外一項研究證實在7/34的病變中存在PTEN基因突變（21%）。免疫組化研究證實在不伴癌的卵巢和非卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病灶當(dāng)中發(fā)生少見的ARID1A的免疫組化的丟失（意味著ARID1A的功能基因突變）。以上所有這些研究都是采用了低分辨率的基因測序技術(shù)，并且沒有分離內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)，同時也沒用通過正交試驗驗證。因此，對于一些基本的問題僅能給出模棱兩可的答案，例如：在子宮內(nèi)膜異位相關(guān)卵巢腫瘤之外良性子宮內(nèi)膜異位病變是否有體細(xì)胞癌癥驅(qū)動基因的體細(xì)胞基因突變，如果有的話，它在這些病變的病因?qū)W當(dāng)中發(fā)揮怎樣的作用？

該研究中采用全外顯子測序和靶向擴增子技術(shù)并用兩種數(shù)字基因組方法檢測是否良性的，但是有侵襲性的深部子宮內(nèi)膜異位病變有體細(xì)胞突變，包括常常在癌癥中發(fā)現(xiàn)的常常突變的基因。

組織標(biāo)本分別從三組深部子宮內(nèi)膜異位癥的患者獲取。所有組織均經(jīng)福爾馬林固定/石蠟包埋，或分子固定/石蠟包埋。樣本組織均經(jīng)病理學(xué)家證實深部子宮內(nèi)膜異位癥，均含上皮和間質(zhì)細(xì)胞，沒有癌癥或不典型增生，標(biāo)本的大小足夠組織修剪、大體切割或激光捕獲顯微切割。

子宮內(nèi)膜異位病灶和相應(yīng)正常組織經(jīng)組織取芯，切成2-3mm的蠟塊，固定、包埋并HE染色。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)Illumina程序建立包含子宮內(nèi)膜異位和正常組織樣本的末端配對文庫。編碼區(qū)采用AgilentSureSelected系統(tǒng)捕獲，并用Illumina測序。采用單分子條形碼安全測序系統(tǒng)來減少組織固定和低突變頻率帶來的錯誤測序。凈化后的產(chǎn)物采用Illumina MiSeq測序并分析突變。

ARID1A免疫反應(yīng)性被用來做為ARID1A突變失活的替代物。福爾馬林固定并石蠟包埋后的組織切片，用1:2000稀釋的ARID1A抗體人工染色。

結(jié)果

實驗研究的對象是非卵巢型的39名深部子宮內(nèi)膜異位癥的女性，平均年齡37歲。其中一組患者采用獨立分子遺傳分析引入用作平行對照，進(jìn)行了非偏倚全外顯子基因組測序，采用安全測序系統(tǒng)確認(rèn)驅(qū)動基因突變，并且采用了免疫組化分析的方法；另一組患者采用微流體數(shù)字PCR技術(shù)確保四倍靶向PANEL為基礎(chǔ)的測序；第三組單獨采用微流體數(shù)字PCR分析。

全外顯子測序分析

24名患者進(jìn)行了全外顯子基因測序（1到24號患者），從內(nèi)膜異位癥組織中提取DNA，并用正常組織做對照。發(fā)現(xiàn)了80個非同義體細(xì)胞突變，包含61個錯義突變，5個無義突變，5個插入缺失突變產(chǎn)生的移碼突變，7個框內(nèi)插入缺失突變，另有2個經(jīng)典結(jié)合位點突變。每塊組織發(fā)生復(fù)變的的數(shù)目有較大差異（0到17），平均每塊病變組織的突變數(shù)為3.3；有5塊組織沒有找到突變。等位基因突變頻率通常較低（小于20%），說明只有一小部分的細(xì)胞發(fā)生了突變。有5塊病變組織有癌癥驅(qū)動基因的體細(xì)胞突變，2塊組織發(fā)生了腫瘤抑制基因ARID1A的失活突變(p.L2253Cfs*14 in Patient 9 andp.G276Efs*87 )?；罨蛲蛔兊臒狳c發(fā)生在PIK3CA(c.3127A→G;p.M1043V)(p.L2253Cfs*14 in Patient 9 and p.G276Efs*87，每個突變分別發(fā)生在一塊組織。其他的突變都是與癌驅(qū)動基因無關(guān)的突變。

癌驅(qū)動基因如ARID1A,PIK3CA, KRAS, and PPP2R1A 等位基因突變頻率從6%到17%不等，且與非癌癥驅(qū)動基因沒有顯著差異。外顯子資料也被用來評估DNA拷貝數(shù)，然而只有個10號病人獲取了少量的拷貝數(shù)。

安全測序系統(tǒng)驗證了體細(xì)胞突變的存在，并驗證了等位基因突變頻率。KRAS基因熱點突變（15號患者）另外采用激光捕獲顯微切片的辦法分離上皮和間質(zhì)成分。發(fā)現(xiàn)突變發(fā)生在上皮而不是間質(zhì)。ARID1A免疫活性的丟失做為突變失活的表現(xiàn)，在20號患者發(fā)現(xiàn)了這種情況（也是在上皮組織）。6號患者PPP2R1A上皮部分的突變被微流體數(shù)字PCR檢測到，但是這位患者沒有采集到單純的間質(zhì)樣本。

癌癥驅(qū)動基因深度測序分析

一組獨立的實驗分析了3位患者（25-27）的組織樣本，采用兩種靶向PANEL，分析了所有的5個基因(NRAS, BRAF, FGFFR2, HRAS, and KRAS) 的熱點區(qū)域，6個基因(PIK3CA,PTEN, TP53, CDKN2A, CTNNB1, andFBXW7 )的全部編碼序列。激光捕獲顯微切割分離兩種組織成分，如果在4個PANEL都被發(fā)現(xiàn)，并且在DNA種系中缺如的話，就確認(rèn)基因突變。在這3個患者中，有個2人有體細(xì)胞KRAS活化突變，然而，沒有發(fā)現(xiàn)其他的體細(xì)胞突變。25號患者有c.35G→T和c.35G→TKRAS突變，等位基因突變頻率分別在11.2%和8.6%。26號患者有單獨的c.35G→T KRAS突變，等位基因突變頻率10.4%。

KRAS基因突變通過微流體數(shù)字PCR驗證。25號患者同一塊組織的相鄰的2個區(qū)域發(fā)生了c.35G→T 和c.35G→C的突變。分析驗證了在同一內(nèi)膜異位的上皮組織中存在兩種突變：c.35G→T 的突變頻率在兩塊組織分別是24%和37%， c.35G→C分別是33%和16%。

26號患者來自不同內(nèi)膜異位病灶組織的2塊病變的分析發(fā)現(xiàn)上皮組織KRAS c.35G→A突變，突變頻率31%。KRAS突變在2組患者（3/27）中都被檢測到，研究分析了另外12名患者（28-39號患者），采用微流體數(shù)字PCR技術(shù)檢測5種KRAS基因12號密碼子突變(c.35G→A [p.G12D], c.35G→T [p.G12V], c.35G→C [p.G12A],c.34G→C[p.G12R], and C.34G→T [p.G12C]) 。人工切割病變組織，如有陽性發(fā)現(xiàn)的話采用激光捕獲顯微切割，如有必要的話上皮和間質(zhì)成分進(jìn)行分別的微流體數(shù)字PCR檢測是我們首次采用。12名患者有3人發(fā)生了KRAS基因突變（25%）。28號患者c.35G→A (p.G12D) 的突變，3塊獨立的病變組織和正常組織分別進(jìn)行分析，3塊解剖上完全獨立的病變腺上皮組織都發(fā)生了KRAS c.35G→A 突變。然而，沒能夠發(fā)現(xiàn)該患者間質(zhì)或者正常在位子宮內(nèi)膜上皮的突變。

盡管人們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥已經(jīng)有一個世紀(jì)的歷史，除了它的高發(fā)病率和它對女性健康相關(guān)生活質(zhì)量的影響，其發(fā)病的生物學(xué)過程卻知之甚少。從社會經(jīng)濟學(xué)的角度，也很有必要研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病。僅在美國，每年因為子宮內(nèi)膜異位癥住院的患者，每次住院花費超過12,000美元，每年超過11,000的患者患此病，每年的花費超540億美元。本研究聯(lián)合采用二代測序技術(shù)、高敏感數(shù)字基因組技術(shù)研究良性的深部子宮內(nèi)膜異位癥病變，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病變有體細(xì)胞的突變，包括眾所周知的癌癥驅(qū)動基因ARID1A, PIK3CA, KRAS, and PPP2R1A。

研究對子宮內(nèi)膜異位癥病人基因突變的研究結(jié)果應(yīng)審慎的對待，因為ultra-low-input測序技術(shù)和福爾馬林固定組織的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。應(yīng)有更全面的基因組測序或表觀遺傳學(xué)的研究來證實更多的基因突變。盡管如此，研究所發(fā)現(xiàn)的基因突變以往更多的是在子宮內(nèi)膜異位相關(guān)卵巢腫瘤，或者是子宮內(nèi)膜異位相關(guān)卵巢腫瘤的遠(yuǎn)處的子宮內(nèi)膜異位病灶當(dāng)中的研究。需要特別關(guān)注的是，子宮內(nèi)膜異位癥通常被認(rèn)為是良性的炎癥性疾病，不伴有癌癥的子宮內(nèi)膜異位病變的癌相關(guān)基因突變（尤其是在很少惡性轉(zhuǎn)化的深部子宮內(nèi)膜異位癥）的發(fā)現(xiàn)令人意外。這些突變是深部子宮內(nèi)膜異位癥的固有特點，也提出了對子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的令人感興趣的問題。

以往，對于子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢腫瘤伴發(fā)的子宮內(nèi)膜異位癥病變的研究顯示了腫瘤組織和子宮內(nèi)膜異位癥組織均存在誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)展為癌癥的基因突變。然而，子宮內(nèi)膜異位癥的惡性轉(zhuǎn)化率約為1%，結(jié)果表研究明，僅僅是驅(qū)動基因突變既不足驅(qū)動子宮內(nèi)膜異位癥的惡性轉(zhuǎn)化，也不足以證明病變向惡性轉(zhuǎn)化的可能。除此之外，實驗僅證實了少數(shù)的患者有驅(qū)動基因突變，現(xiàn)有的研究證明驅(qū)動基因并不是深部子宮內(nèi)膜異位病灶向惡性轉(zhuǎn)化所必須。也可能更重要的是，該研究對以往的研究提出挑戰(zhàn)，以往的經(jīng)典研究是把子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢腫瘤與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)聯(lián)，并研究單個候選基因突變，現(xiàn)在看來這些研究并不足以證明病變惡性轉(zhuǎn)化的可能。

在80個突變基因中發(fā)現(xiàn)的5個驅(qū)動基因突變在125個驅(qū)動基因突變哭中的幾率P=0.001（雙端檢驗），也就是說，這種突變是偶然發(fā)生的幾率非常低。因為驅(qū)動基因突變僅發(fā)生在上皮細(xì)胞而不是間質(zhì)，可以假設(shè)，所觀察到的基因突變?yōu)樽訉m內(nèi)膜異位癥上皮細(xì)胞提供了關(guān)鍵的選擇優(yōu)勢。這種上皮細(xì)胞的顯著的選擇的壓力導(dǎo)致同一病變的不同克隆種群。例如，25號患者有兩種12號密碼子KRAS基因突變。

深部子宮內(nèi)膜異位癥可以侵犯其他臟器，并改變局部解剖，然而在表淺的子宮內(nèi)膜異位癥亞型，并不發(fā)生局部浸潤，但是解剖學(xué)的改變是有的。這些不同的表型背后的生物學(xué)過程仍然未知。我們的研究對目前具有侵襲性的子宮內(nèi)膜異位癥亞型的理解提出挑戰(zhàn)，也提出了是否深部子宮內(nèi)膜異位癥可以被描述為一種良性腫瘤這樣新的問題。28號患者在3處不同的病變組織中都發(fā)現(xiàn)了相同的KRAS基因突變，也提高了良性的深部子宮內(nèi)膜異位癥來自遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的新生腫瘤的過程。這些發(fā)現(xiàn)可以有幾種解釋。首先，突變的發(fā)生都是彼此獨立的。然而，3塊組織的同一突變單獨發(fā)生的幾率也很小。其次，突變可能在一塊病變組織發(fā)生，然后轉(zhuǎn)移到了其他位點。這種可能支持子宮內(nèi)膜異位上皮細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化學(xué)說，但并不特別的支持子宮內(nèi)膜遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或播散的學(xué)說。盡管如此，如果我們選擇接受這種解釋，也要考慮到還有沒有突變的間質(zhì)細(xì)胞的問題。間質(zhì)成份是上皮細(xì)胞發(fā)揮作用不可或缺的部分，間質(zhì)成份在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程中或者是共同移居，或者新招募。或者它在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生突變后通過非子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。最后，間質(zhì)和上皮成份起源于子宮干細(xì)胞也有可能。干細(xì)胞相關(guān)理論可能為單個細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供支持，然而，這可能需要為迄今為止我們發(fā)現(xiàn)的癌癥驅(qū)動基因突變僅發(fā)生在上皮細(xì)胞這一發(fā)現(xiàn)提供特別的解釋。顯然，這種假說需要更多的驗證，但是它對于罕見的或者遠(yuǎn)處的子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病更有說服力（例如肺、脊髓和腦）。

目前子宮內(nèi)膜異位癥的臨床分型既不是根據(jù)生物學(xué)，也不是基于強有力的臨床行為的預(yù)測。因此，有必要修正或者重新設(shè)計以生物學(xué)為基礎(chǔ)的分型。此項研究為所有的子宮內(nèi)膜異位癥亞型提供了強大的有理的證據(jù)和分子學(xué)的基礎(chǔ)來進(jìn)行更深入的研究。

總之，盡管子宮內(nèi)膜異位癥無論從臨床或是病理都被認(rèn)為是良性的病變，眾所周知的癌相關(guān)體細(xì)胞突變在一些深部子宮內(nèi)膜異位腺上皮中被發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為利用以往研究癌癥的方法來更詳細(xì)的解釋子宮內(nèi)膜異位癥的所有存在形式創(chuàng)造了新的機會。